Crispr/Cas9: knippen en plakken

In recente nieuwsberichten over biotechnologie valt vaak de term ‘CRISPR/Cas9’, maar wat is dat nu eigenlijk?

Copyright, Image courtesy of Stephen Dixon and Feng Zhang

Moderne biotechnologie gaat steeds over het veranderen van DNA. Heeft een organisme een ongewenste erfelijke eigenschap, dan knip je die ongewenste eigenschap uit het DNA. Wil je juist een eigenschap toevoegen, dan zorg je dat het organisme voortplantingscellen maakt, waaraan het DNA voor die eigenschap is toegevoegd.

Het makkelijkst gaat dat bij bacteriën. Die maken geen voortplantingscellen, maar delen zichzelf. Zolang je maar zorgt dat het stukje DNA met de extra eigenschap ook deelt, kun je een kolonie kweken die de gewenste eigenschap heeft. Vaak wordt DNA los aan de bacterie toegevoegd, en blijft het DNA van de bacterie zelf geheel intact.

Iets aan het DNA zelf veranderen, was tot voor kort onbegonnen werk. Het betekent dat je moet zoeken welk stukje DNA in het totale genoom voor een bepaalde eigenschap wordt gecodeerd. Vervolgens moet je dat stuk DNA eruit knippen, en een nieuw stuk – dat codeert voor de gewenste eigenschap – ervoor in de plaats plakken.

De voormalige atoomtuin in Hitachiomiya, Japan.
Het 'gamma field' in Hitachiomiya, Japan wordt niet meer als zodanig gebruikt, maar ligt er desolaat bij temidden van talloze golfbanen. Zó werd genetische manipulatie in de eerste decennia na de Tweede Wereldoorlog gedaan: in het midden van zo'n atomic garden kwam een stralingsbron, en met wat geluk zorgde die precies de juiste mutaties in de gewassen eromheen.

Tuinieren met straling

Een beproefde methode om DNA te muteren, is om het bloot te stellen aan radioactieve straling. Aanvankelijk toegepast in testlaboratoria om te zien wat het effect was van blootstelling aan radioactieve bronnen, ontwikkelden verschillende labs in de tweede helft van de twintigste eeuw meer dan tweeduizend bruikbare mutaties in voedselgewassen. Die methode is bekend geraakt als atomic gardening, en is niet erg precies. Het is een beetje alsof je willekeurig wat ingrediënten in een pan gooit, en achteraf proeft of het een smakelijke soep heeft opgeleverd.

Een nieuwe methode is CRISPR/Cas9, ontwikkeld in 2015 vanuit een truc die bacteriën al langer onder de knie hadden. Als een virus een bacterie aanvalt, zal het zijn DNA in de bacterie inbrengen om daar te laten reproduceren. Maar sommige bacteriën hebben een uitgelezen verdedigingsmechanisme: ze hebben in hun DNA een databank opgebouwd van virus-DNA, zodat zodra een virus DNA inbrengt in de bacterie, deze laatste dit DNA herkent en vernietigt. Ze doen dit door een stukje van het ‘opgeslagen’ virus-DNA te reproduceren. Dat stukje hecht zich aan Cas9; een eiwit dat in staat is dna te knippen. Op het moment dat het geïnjecteerde virus-DNA in de buurt komt en het past op het gereproduceerde stukje, dan omarmt Cas9 het virus-DNA en knipt het in tweeën.

Palindroom-DNA

In bacteriën wordt zo’n reproductiestukje van het virus-DNA ingebouwd in het eigen DNA, temidden van twee stukjes palindroom-DNA. Dat palindroom-DNA leest twee kanten uit precies hetzelfde. Juist de aanwezigheid van palindromen in het bacteriële DNA bracht onderzoekers aanvankelijk op het spoor van CRISPR, en daaraan dankt CRISPR dan ook zijn naam: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats.

Behalve een hele serie CRISPRs heeft zo’n bacterie ook nog code in het DNA om te coderen voor CRISPR Associated Sequences (Cas). Eenmaal uitgelezen leveren die codes een aantal eiwitten op. Eiwit Cas9 zorgt voor het knippen van DNA op basis van het DNA-strengetje dat eraan is toegevoegd. Onderzoekers zijn erin 2015 in geslaagd om Cas9 zo te bewerken, dat elk gewenst stukje DNA eraan geplakt kan worden.

infographic over de werking van crispr/cas9
De CRISPR-cas9 techniek maakt het mogelijk om DNA van cellen of organismen zeer gericht te veranderen. Dankzij ‘gids- RNA’ kan het Cas9 enzymsysteem zeer specifiek binden aan dubbelstrengs DNA en de bewuste sequentie doorknippen. Op die plek kan vervolgens donor-DNA worden ingebracht. Bij CRISPR-cas9 is de knip recht; bij de alternatieve CRISPRCpf1 techniek worden zogenoemde ‘sticky ends’ gevormd, wat het inbouwen van donor-DNA vergemakkelijkt. PAM staat voor ‘protospacer adjacent motif’, een stukje van 2 tot 6 baseparen, dat onmiddellijk na de doelwitvolgorde zit en dat noodzakelijk is voor binding.

Repareren

DNA veranderen met CRISPR/Cas9 gaat dan in theorie als volgt: je maakt zelf een stukje DNA waarvan je weet dat het in een cel voorkomt, en dat je wilt vervangen door iets anders. Je plakt dat stukje gids-DNA aan Cas9, en stuurt die Cas9 de cel in, samen met het stukje nieuw DNA dat in de plaats moet komen van wat je weg wilt knippen.

Cas9 vouwt zich vervolgens op willekeurige plaatsen om het dna in de cel. Zodra het gids-DNA daarbij past op het DNA waar Cas9 zich omheen gevouwen heeft, knipt Cas9 het corresponderende DNA door. Het DNA wil zich vervolgens natuurlijk weer repareren, en pakt daarvoor de bouwstenen die het meest voor de hand liggen, namelijk de stukken DNA die samen met Cas9 de cel in waren gestuurd.

Tot nu toe zorgt CRISPR/Cas9 vooral voor grote doorbraken in de microbiologie en aanverwante vakgebieden. CRISPR/Cas9 leent zich bijvoorbeeld goed om heel precies bepaalde genen uit te schakelen en te bezien wat het effect daarvan is op het functioneren van een organisme. Of om precies die genen uit te zetten, die je in je onderzoek liever niet actief hebt. De mogelijkheden die CRISPR/Cas9 biedt voor onderzoek, zijn zeer groot. ‘Het is een schitterende gift die we danken aan microben. Want wat voor mooie dingen wetenschappers er ook mee weten te maken, het blijft natuurlijk gebaseerd op iets dat bacteriën en archaea in miljoenen jaren hebben ontwikkeld als afweersysteem tegen virussen’, vat de Wageningse microbioloog John van der Oost het samen in een artikel in bionieuws.

Het is niet moeilijk om je voor te stellen dat de techniek ook binnen de plantveredeling, fokkerij of geneeskunst voor grote doorbraken kan zorgen. Een voorbeeld: stel, iemand draagt het BRCA1-gen, een gen dat op latere leeftijd bij vrouwen borstkanker veroorzaakt. Je zou zo’n gen kunnen repareren, als je de bevruchting in een reageerbuis laat plaatsvinden en vlak na de bevruchting het gen met behulp van CRISPR/Cas9 in een embryo repareert. Nu kan dat nog niet, maar we weten niet hoe lang het duurt voor het wel kan. De algemene verwachting is dat CRISPR/Cas9 voor grote veranderingen in het voorkomen en genezen van erfelijke aandoeningen kan gaan zorgen.

Wie beter dan Jennifer Doudna kan vertellen wat Crispr/cas9 doet? Ze stond aan de wieg van de technologie. (Engels)